教育类期刊约稿

采用流式细胞仪鉴定3种秋海棠愈伤组织的遗传变异

摘要：采用流式细胞仪，对3种离体培养多年的秋海棠属植物的DNA含量进行了测定。结果表明：掌叶秋海棠的DNA含量发生了非整倍性变化，离体培养材料是温室保存材料的1.5倍，其它两种秋海棠的DNA含量无明显变化。

关键词：秋海棠；愈伤组织；变异；DNA含量

离体保存是种质资源保存的一条重要途径，具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点。但是，在离体保存过程中常有遗传变异的发生，这种变异称为体细胞无性系变异^[1]，因此需要对离体保存材料进行鉴定。目前的鉴定方法包括形态学标记、细胞学标记、分子标记等。

秋海棠属植物的染色体很小，计数十分困难。而且某些种类的细胞质中含有许多小颗粒，与因缢缩而变得极小的染色体难以区分^[2]。采用压片技术观察费时且难度较大。本研究采用美国BD公司的流式细胞仪，对3种培养多年的秋海棠进行了DNA含量分析，以期为进一步研究该属植物离体培养的遗传变异规律提供基础。

1.材料与方法

1.1植物材料

供试材料为温室中保存和以愈伤组织形式保存10年的的花叶秋海棠（B. cathayana）、掌叶秋海棠(B. hemsleyana)和假厚叶秋海棠（B. pseudodryadis）。继代培养基为1/2MS培养基，不加任何激素，每2个月继代一次。实验前随机选取3种秋海棠属植物的部分愈伤组织材料进行培养，直至有幼嫩叶片长出。

1.2 方法

选取幼嫩叶片约1cm²，加入0.5ml的OttoⅠbuffer和2μl/ml的β-巯基乙醇，用手术刀将其切碎，室温孵育30min后用200目的尼龙网过滤，得到悬浮液。采用同样的方法获得水稻的悬浮液。往悬浮液中加入1ml的OttoⅡbuffer(50μg·L^-1的碘化丙啶和50μg·L^-1的RNase)，200目尼龙网过滤后置于常温黑暗条件下染色1h。

1.3分析方法

    流式细胞仪系统为FACSAria（美国BD公司）。采用488nm和5×10⁸的蓝光激发，检测碘化丙啶（PI）的发射荧光强度。以水稻为内标，每个种测定5个样品，每个样品至少收集20,000个细胞，变异系数控制在8%以内。使用BDFACSDiva软件分析数据。DNA含量差异显著性分析采用SPSS13.0分析软件。

2 结果与分析

结果表明，离体保存的三种秋海棠植物中，掌叶秋海棠的DNA含量发生了非整倍性变化，离体培养材料的DNA含量是保存在温室中材料的1.5倍，其它两种秋海棠的DNA含量无明显变化（表1）。

3讨论

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是目前染色体倍性鉴别中一种快速、有效地方法，它可以直接或间接测定细胞的DNA含量。20世纪90年代国内开始就有学者将FCM运用到植物倍性分析中^[3]。

通过对3种秋海棠DNA含量的测定，我们发现，掌叶秋海棠的DNA含量发生了非整倍性变化，而其它两种秋海棠属植物的DNA含量没有发生变化。这3种秋海棠植物于同时进行离体保存，保存的时间和条件均相同，但它们的DNA含量变化的情况并不相同，说明植物体本身是影响变异的重要因素。另外，掌叶秋海棠的DNA含量为非整倍性变化，其原因可能是愈伤组织在培养的过程中由于单个染色体的丢失或获得、不分离和染色体滞后所致^[4]。张俊娥等认为，在愈伤组织中有DNA含量加倍的现象是否就一定是染色体数目发生变化，不能仅仅通过DNA含量分布曲线来下结论，还需对其进性细胞周期分析。因为细胞处在分裂间期的S期时DNA进行复制，DNA含量也要加倍^[5]。所以，对于掌叶秋海棠DNA含量发生非整倍性变化的原因还有待于进一步研究。